841653730125 心肺复苏脑损伤过程中delta阿片受体系统的作用评价_
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心肺复苏脑损伤过程中delta阿片受体系统的作用评价
作者: 来源: 阅读次数: 发表日期:2014/4/10 20:58:23
窒息性心跳停止(CA)是全脑缺血的一个重要原因,成功复苏后,仅有4-12%的患者出院时神经系统功能完好。迄今为止仍没有能够有效减少复苏后神经系统并发症的理想的脑保护药物。Delta阿片受体(DOR)在改善脑缺氧、缺血损伤的病理生理过程中发挥着积极的、重要的作用,我们推测DOR在心肺复苏脑损伤过程中同样扮演重要角色。本项目建立大鼠窒息性心肺复苏脑损伤模型,采用多种研究方法,观察心肺复苏后脑内阿片受体,特别是DOR表达与分布的变化;进一步研究DOR激动剂对心肺复苏脑损伤的保护作用;应用体外培养的大鼠皮层及海马神经元缺氧复氧损伤模型,以G蛋白-PKCs-ERK途径为切入点,从基因表达、蛋白合成等多个层次,探索DOR介导的心肺复苏脑损伤保护作用的胞内信号转导途径。
本研究的结果将能够阐明心肺复苏后中枢神经系统delta阿片受体分布与表达的变化规律,明确DOR激动剂对心肺复苏脑损伤保护作用的量效关系,完善有关DOR参与脑缺血缺氧损伤病理过程的理论;进一步阐明DOR介导的心肺复苏脑损伤保护作用的细胞内信号转导机制,为研制能够减少心肺复苏后神经系统并发症的药物提供研究基础和思路。
1) 研究目标
(1)          明确心肺复苏后内源性阿片肽合成与释放的变化以及阿片受体分布与表达的变化规律,为心肺复苏后内源性阿片肽及其受体参与心肺复苏脑缺血损伤过程提供依据;
(2)          明确delta阿片受体激动剂DADLE对改善心肺复苏后脑损伤的保护作用,寻找最为合适的治疗剂量与时机;
(3)          通过观察DADLE对PKCs-ERK-Bcl-2信号途径分子的作用,初步阐明DOR介导心肺复苏大鼠脑损伤保护作用的胞内信号转导机制。
2)研究内容
1)研究心肺复苏后脑组织内源性阿片肽及阿片受体的变化规律
建立大鼠窒息性心肺复苏脑损伤模型,根据复苏后时间分组,采用放射免疫分析法在连续时段上动态观察窒息性心肺脑复苏后内源性阿片肽在脑组织、脑脊液、血液中含量的变化;运用免疫组化染色、Real-time PCR、Western blot分析等方法,观察心肺复苏后阿片受体特别是delta阿片受体在脑内分布改变以及在mRNA和蛋白水平表达的变化,探索内源性阿片肽及其受体的变化规律,进一步明确delta阿片受体参与心肺复苏脑损伤的病理过程。
2)观察DOR激动剂和拮抗剂在心肺复苏脑损伤过程中的作用
采用不同的给药时机(心跳停止前30min和循环恢复后10min)和药物剂量,从动物神经功能损伤评分、Morris水迷宫测试、血清中神经元损伤标志物水平、Nissl染色、电镜下超微结构变化等多个方面,观察Delta阿片受体激动剂DADLE对大鼠心肺复苏后脑损伤的保护作用,明确量效关系,寻找最为有效的治疗剂量和给药时间;在DADLE给药的基础上,复合使用DOR特异性拮抗剂naltrindole,观察其对DADLE保护作用的影响,明确DADLE对心肺复苏脑损伤的保护是通过激活delta阿片受体起作用的。
3)验证PKCsERKBcl-2信号途径分子在心肺复苏脑损伤模型中的表达
实验动物分为Sham组、心肺复苏组(CA组)、DADLE组、DADLE+CA组、DADLE+naltridole+CA组,运用免疫组化、Real-time PCR、Western blot 等方法,研究检测皮层和海马部位ERK、Bcl-2和p38 MAPK、细胞色素C在mRNA及蛋白水平表达变化,以明确在心肺复苏脑损伤模型上激活DOR对PKCs-ERK-Bcl-2信号途径有关分子的影响。
4)观察DOR激动剂和拮抗剂对体外培养缺氧复氧损伤神经元的影响
为了进一步证实我们关于DOR介导心肺复苏脑保护信号转导途径的推断,需要使用多种相关的阻断剂。为了避免这些药物对活体动物的不良影响,我们分离培养大鼠原代皮层及海马神经元作为研究对象。对培养的神经元采用联合缺氧缺糖模拟缺血,以恢复氧和糖供应模拟复苏再灌注,观察缺氧前使用DADLE以及naltrindole 对缺氧复氧神经元凋亡和细胞活力的影响,确定最佳的有效浓度。同时运用Real-time PCR、Western blot 等方法检测缺氧复氧神经元ERK、Bcl-2和p38 MAPK、细胞色素C在mRNA及蛋白水平表达变化。
5)验证G蛋白-PKCs途径对下游MAPKS分子的调节作用
 分离培养大鼠原代皮层及海马神经元,在缺氧复氧前给予DADLE,同时在培养液中分别给予G蛋白阻断剂PTX(百日咳杆菌毒素)、PKC抑制剂Calphostin C和PKA抑制剂H89,观察对缺氧复氧神经元凋亡和细胞活力的影响,检测对缺氧复氧神经元ERK、Bcl-2和p38 MAPK、细胞色素C在mRNA及蛋白水平表达变化的影响。
6)观察MAPKS分子在PKCsERKBcl-2途径中的作用
分离培养大鼠原代皮层及海马神经元,在缺氧复氧前给予DADLE,同时在培养液中分别给予p38MAPK 抑制剂SB202190、JNK抑制剂SP600125、ERK抑制剂U0126,观察对缺氧复氧神经元凋亡和细胞活力的影响,检测对缺氧复氧神经元ERK、Bcl-2和p38 MAPK、细胞色素C在mRNA及蛋白水平表达变化的影响。
 
3研究计划
首先
     建立大鼠窒息性心肺复苏脑损伤模型,在连续时段上动态观察窒息性心肺脑复苏后内源性阿片肽在脑组织、脑脊液、血液中含量的变化;
     研究阿片受体特别是delta阿片受体在脑内分布改变以及在mRNA和蛋白水平表达的变化,证明delta阿片受体参与心肺复苏脑损伤的病理过程。
然后:
     观察Delta阿片受体激动剂DADLE对大鼠心肺复苏后脑损伤的保护作用,明确量效关系,寻找最为有效的治疗剂量和给药时间;
     在DADLE给药的基础上,复合使用DOR特异性拮抗剂naltrindole,观察其对DADLE保护作用的影响,明确DADLE对心肺复苏脑损伤的保护是通过激活delta阿片受体起作用的;
     在心肺复苏脑损伤模型上观察激活DOR对PKCs-ERK-Bcl-2信号途径有关分子的影响。
最后:

分离培养大鼠原代皮层及海马神经元并建立缺氧复氧损伤模型,验证Delta阿片受体是通过PKCs-ERK-Bcl-2信号转导途径发挥对心肺复苏大鼠脑损伤保护作用的;